Церковное песнопение, согласно многочисленным иллюстрациям и пометкам в канционалах, сопровождалось инструментальной музыкой. Значимость инструментального сопровождения была усилена в католических церквях иезуитами. В качестве главного аккомпанирующего инструмента был признан орган. Было построено несколько десятков этих инструментов, самый известный - в соборе святого Вита в Праге. Орган достроил в 1567 году мастер Яхим Руднер из города Чешские Будеевице.

Император Фердинанд I (1526-1564) основал придворную капеллу, которая стала самым важным музыкальным ансамблем в чешских землях. Сначала ансамбль состоял из хора и двух органистов, позже императоры Максимилиан и Рудольф II расширили персональный состав ансамбля. Чехов в этом оркестре практически не было, большинство музыкантов приехало в Чехию из Голландии, Испании, Германии и Италии. Капельмейстером был в течение 35 лет Филипп де Монте (1521-1603), композитор, автор месс, мотетов и мадригалов. По примеру императорского двора оркестры стали основывать и дворяне в своих загородных дворцах. Во второй половине 16-го века самой знаменитой была капелла Рожмберская из Крумлова, заслугами Вилема и Петра Воков из дворянской семьи Рожмберков. Самый большой оркестр был в начале 17-го века при замке Пецка. Основал его Криштоф Гарант из Полжиц (1564-1621), дворянин, дипломат, полководец и писатель, которого казнили за участие в чешском восстании. Из его творчества сохранились мотет для шести голосов Qui confidunt in Domino (Те, кто верят в Бога,1598), мотет для пяти голосов Maria Kron, и необыкновенно красивая месса о страдающей матери Missa quinis vocibus super Dolorosi martyr из известного мадригала Марензиа.

Как сольный и аккомпанирующий инструмент была широко распространена лютня. В Праге самым известным пражским лютнистом был Ян Венцалек.

С 15-го и 16-го веков сохранились мелодии некоторых чешских светских народных песен, например «Čížku, ptáčku zeleného peří», «Proč kalina v struze stojí», «Stojí lipka v širém poli», или «Dorna chodí po louce».